Uso MALDI TOF

PROPÓSITO: Describir la metodología de MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time
of Flight).para la identificación de microorganismos
ALCANCE: aislamientos de microorganismos pertenecientes a grupos de riesgo 1 y 2 de los distintos
laboratorios que conforman el INEI
1.-DEFINICIONES Y ABREVIATURAS
GRUPO DE RIESGO I: Bajo riesgo individual y comunitario (requieren nivel de contención 1). Este grupo
incluye aquellos microorganismos que no causan enfermedades a trabajadores de
laboratorio y animales.
GRUPO DE RIESGO II: Moderado riesgo individual y riesgo comunitario limitado (requieren nivel de
contención 2). Este grupo incluye patógenos que pueden causar enfermedades a
humanos o animales, pero bajo circunstancias normales, no producen riesgos serios
a trabajadores de laboratorio, la comunidad, los recursos naturales o el
medioambiente. Las exposiciones de laboratorio rara vez conducen a infecciones
que produzcan enfermedades serias. Existen tratamientos efectivos, medidas
preventivas y el riesgo de dispersión en la comunidad es bajo.
MALDI TOF: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight
HCCA: matriz, ácido 4-hidroxi α-cianocinámico
BTS: estándar bacteriano
TFA: ácido trifluoroacético
AN: acetonitrilo
SO: solvente orgánico
AF: ácido fórmico
EtOH: etanol
2-RESPONSABLES operadores con entrenamiento certificado por profesional responsable
designado. (Registro entrenamiento MALDI TOF)
3-INSTRUCCIONES
3.1.- Fundamentos teóricos acerca de la tecnología Maldi Biotyper 3.1
La espectrometría de masas mediante la tecnología MALDI-TOF MS (matrix assisted laser desorption
ionization-time of flight-mass spectrometry), ha demostrado ser una herramienta de identificación bacteriana
rápida, confiable y específica Download the Marsan novel. Esta metodología permite la identificación de microorganismos mediante el
análisis de proteínas, principalmente ribosomales, a partir de colonias a través de la creación de un espectro
de masas, el cual es específico para cada especie.
Los espectrómetros de masas están formados por tres elementos básicos. En primer lugar la «fuente de
iones», donde a partir de la muestra se forma un haz de iones en estado gaseoso. En segundo término
el «separador de masas» o «tubo de vuelo», que separa los iones formados en función de su relación
«masa/carga» (m/z), y en tercera instancia el «detector» de los iones previamente separados.
La información final que nos proporciona esta técnica es la relación m/z de los distintos iones
formados y en que cantidad relativa están presentes.
3.2.-MANTENIMIENTO DEL EQUIPO: se realizan mantenimientos preventivos una vez al año, a cargo de
ingenieros de la empresa Bruker Daltonics. Se registra la actividad realizada en una carpeta donde se deja
constancia de la certificación del ingeniero de la empresa.
Se realizan mantenimientos correctivos cuando lo solicita el usuario, debido a fallas o mal funcionamiento del
equipo, a cargp de ingenieros de la empresa Bruker en forma presencial o vía remota y se evalúa el
procedimiento con el posterior desempeño del equipo 더 임파서블.
3.3.-CONDICIONES DE SEGURIDAD: durante el procesamiento de las muestras se debe trabajar en
cabinas de seguridad biológica de clase II y empleando elementos de protección personal. VER MANUAL DE
BIOSEGURIDAD MO-BE-03_00
Al largar una corrida en el equipo, no se requieren medidas de bioseguridad; pero sí se deberán cumplir ciertas
condiciones ambientales de temperatura (18-22 grados) y humedad (menor al 70%) constantes y limpieza del
ambiente (libre de polvo y talco).
3.3.- OPERACIONES PRELIMINARES
3.3.1.- Preparación del SO Ver IT –BE-19_00
3.3.2.-Preparación y almacenamiento de la matriz Ver IT –BE-20_00
3.3.3.- Preparación y almacenamiento del BTS Ver IT –BE-18_00
3.3.4.- Procedimiento de calibración
• Agregar 1 μl de BTS en uno o varios spots de la placa
• Dejar secar a temperatura ambiente
• Cubrir inmediatamente con 1 μl de matriz
• Dejar secar a temperatura ambiente
• Insertar la placa en el equipo. Existen dos formas de realizarlo:
1. Preferentemente, desde el programa Flex Control, seleccionando el botón IN/OUT (Figura 1)
2. Con el botón verde del equipo “IN/OUT” (con el programa Flex Control maximizado)
• Una vez en modo OUT, se podrá abrir la tapa del equipo. Insertar la placa en el Maldi Biotyper
(Figura 2), cerrar tocando nuevamente la flecha (Figura 1)
• Aguardar que el equipo ingrese a modo “IN”
•
Figura
1
Figura
2 2
• En la ventana del programa Flex Control verificar la generación de vacío en el equipo.
Seleccionar “STATUS” / “DETAILS” / “VACUUM” (Figura 3, 4)
• Aguardar hasta que el punto “Source High” pase de FAIL (rojo), al OK (verde), (Figuras 4 y 5)
• Luego cerrar solamente la pantalla “VACUUM” (cruz negra)
Figura
3
Figura
5
Figura
4
• Proceder a la calibración
Seleccionar el pocillo de BTS preparado en el día y presionar “CALIBRATE” (Figura 6)
A la derecha de la pantalla se visualizará el espectro y seleccionando la solapa
“CALIBRATION” se podrá verificar que al menos 7 de las ocho proteínas del BTS pasaron la
calibración
Aparecerá una nota indicando la calibración correcta (Figura 7)
Nota: Si no se lograra la calibración automática, puede corregirse mediante calibración manual
Figura
6
Figura
7
Calibración manual
• Seleccionar con el botón izquierdo del mouse, una proteína que no tenga tilde 윈도우7 정품. Al hacerlo
aparecerá en la pantalla el pico correspondiente a esa proteína. Hacer “click” a la izquierda del
pico de esa proteína, en cualquier sector de la pantalla con el botón izquierdo del mouse.
Aparecerá una banda verde y si el error en ppm es menor a 300, seleccionar “APPLY” (Figura
8)
• Repetir este paso con todas las proteínas no tildadas
• Finalmente seleccionar “FILE” – “SAVE METHODS AS” – “SAVE” – “YES”
• Volver a calibrar, presionando “CALIBRATE”
• Aparecerá la nota de calibración correcta
• Minimizar el programa Flexcontrol (no cerrar NUNCA este programa)
Si la calibración manual no puede ser llevada a cabo debido a que el error para cada proteína es mayor a 300
ppm, se debe repetir el procedimiento con nueva alícuota de BTS del mismo tubo
Si la calibración siguiera fuera de rango, se deberá reconstituir nuevo BTS
Si aun no pudiese realizarse una calibración correcta, preparar nuevo solvente orgánico y luego BTS fresco
Nota: Registrar el procedimiento realizado en la planilla de calibración (ver Anexo 8)
Importante: Trabajar rápidamente cuando el tubo de BTS está destapado para evitar su evaporación.
Se recomienda calibrar el equipo cada vez que se lleve a cabo un ensayo, o en dos turnos
(por la mañana y por la tarde) si el flujo de trabajo es continuo.
Figura
8
3.4.- PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
3.4.1.- Criterios de aceptación / rechazo de muestras
Se deberá trabajar con cultivos frescos (18 – 24 horas de incubación). Algunos microorganismos de
crecimiento lento pueden necesitar mayores tiempos de incubación antes de ser testeados.
La metodología acepta cultivos en agar Columbia con sangre de carnero al 5%, agar tripticasa soya,
agar Mac Conkey, agar Chocolate, agar BHI.
No deben utilizarse cultivos refrigerados, debido a que esto puede alterar el espectro y su
reproducibilidad.
Microorganismos esporulados y otros como Levaduras, Micobacterias, Actinomycetales que poseen
pared celular gruesa, pueden no ser identificados por el método directo y requerir métodos de
extracción para su completa identificación battery file.
3.4.2.-Métodos
Método de extendido directo
Materiales:
• Cabina de seguridad biológica
• Placa de 96 pocillos reutilizable
• Escarbadientes
• Tips de 10 μl
• Micropipetas: P10 (1-10 μl)
• Equipo Maldi Biotyper
• Cultivo fresco de microorganismos: realizar cultivos de 18 a 24 horas en los medios de
crecimiento apropiados para cada grupo de bacterias en particular
Reactivos:
• BTS
• Matriz
Procedimiento:
• En la planilla de registro (ver Anexo 9), rotular la posición del BTS, que se utilizará como
control del ensayo, y de cada muestra en estudio, que deberá sembrarse por duplicado
• En la cabina de seguridad biológica y empleando guantes de látex libres de talco, tomar con un
escarbadientes, una sola colonia aislada y realizar un extendido lo más fino posible en un
pocillo. Realizar el segundo spot sin volver a tocar la colonia
• Agregar 1 μl de BTS en un pocillo de la placa. Este paso debe realizarse luego de inoculadas las
muestras ya que es importante que el BTS no permanezca expuesto al aire para evitar la
oxidación de las proteínas
• Una vez secos los pocillos sembrados, cubrir con 1 μl de matriz, comenzando por el BTS
• Dejar secar a temperatura ambiente 5-10 minutos
• Introducir la placa en el equipo y proceder a la identificación
• Ir a 5.3.3
Importante: Durante el procedimiento de siembra, NO sacar la placa de su soporte plástico y no tocar
su superficie.
La metodología es muy sensible y una pequeña cantidad de material biológico suele ser
suficiente; excesos de material biológico pueden llevar a fallas en la clasificación.
Una vez cubiertas las muestras con matriz, la lectura puede ser realizada hasta 3 o 4
horas después de la siembra. En ese caso, guardar la placa en su soporte y en ambiente
fresco y seco, evitando variaciones de temperatura y humedad.
Si es posible dejar esa placa dentro del equipo en estado de vacío, la corrida puede
realizarse hasta 10 o 12 horas luego de la siembra.
Nota: En caso de no lograr una identificación confiable por el método directo, se sugiere realizar el
procedimiento agregando 1 μl de AF 70% al segundo pocillo de cada muestra y luego cubrir con
la matriz.
De no obtenerse los resultados deseados, ensayar la extracción con ácido fórmico.
Método de extracción con ácido fórmico
Materiales:
• Cabina de seguridad biológica
• Placa de 96 pocillos reutilizable
• Equipo Maldi Biotyper
• Vortex
• Escarbadientes
• Eppendorf de 1,5 ml
• Tips de 100 μl – 1000 μl
• Micropipetas P1000 (100 μl – 1000 μl)
• Microcentrífuga
• Cultivo fresco de microorganismos
Reactivos:
• Matriz
• Agua ultrapura
• EtOH 100%
• AF 70%
• AN 100%
Preparación:
• Para 1 ml de AF 70% agregar: 300 μl agua + 700 μl de ácido fórmico puro
• Registrar la preparación en la planilla correspondiente (ver Anexo 1)
Procedimiento:
• Agregar 300 μl de agua en un tubo eppendorf
• Transferir varias colonias aisladas al tubo hasta lograr una turbidez cercana al 3 de Mc Farland
• Pasar por vortex vigorosamente
• Agregar 900 μl de EtOH (de ser necesario detener el proceso, las muestras pueden ser
refrigeradas en este paso)
• Pasar por vortex vigorosamente
• Centrifugar a 13000 rpm durante 2 minutos
• Decantar el EtOH del sobrenadante por inversión
• Centrifugar a 13000 rpm durante 2 minutos
• Remover el exceso de líquido con pipeta Download iRiver Plus 4. Dejar secar a temperatura ambiente hasta evaporación
total
• Agregar 50 μl de AF (si el pellet es pequeño, reducir el volumen de AF a 10 μl).
• Pasar por vortex vigorosamente
• Agregar 50 μl de AN (si el pellet es pequeño, reducir el volumen de AN a 10 μl).
• Pasar por vortex vigorosamente. De realizarse una modificación, el AF y el AN deberán estar
en volúmenes idénticos
• Centrifugar a 13000 rpm durante 2 minutos
• Pipetear 1 μl del sobrenadante en un pocillo de la placa, evitando tocar el pellet. Dejar secar
• Cubrir con 1 μl de matriz. Dejar secar a temperatura ambiente 5 – 10 minutos
• Introducir la placa en el equipo y proceder a la identificación
• Ir a 5.3.3
Nota: Se recomienda realizar este procedimiento en el día y emplear reactivos químicos de alta pureza
para asegurar la calidad de la extracción y del espectro.
3.5.- INTERPRETACION DE RESULTADOS
3.5.1.- Procedimiento de identificación
Manejo de hardware y software (Flex Control, Maldi Biotyper RTC, Maldi Biotyper 3.1)
En el programa Flex Control
– Insertar la placa en el equipo
– Verificar el vacío
– Proceder a la calibración
– Minimizar programa Flex Control (según descripto en el punto 5.2.4)
En el programa MALDI BIOTYPER RTC
– Crear un archivo nuevo para la corrida, seleccionando en “FILE” – “NEW CLASSIFICATION”
(Figura 9)
– En “PROJECT NAME”, escribir el nombre del archivo y luego seleccionar “NEW” (Figura 10)
– En la pantalla de New Project , seleccionar “OK” – “NEXT” (figuras 11 y 12)
Figura
9
Figura 10
Figura 11 Figura 12
– Una vez creado el proyecto, aparecerá la grilla de la placa para asociar las muestras a las
posiciones
– Marcar las posiciones a ensayar y, con el botón derecho del mouse, seleccionar
“ADD ANALYTES” (Figura 13)
– Identificar las muestras en la columna ID. Click en botón “FINISH” (Figura 14)
De inmediato comenzarán a procesarse las muestras y mostrarse los resultados (Figura 15)
– Para imprimir un informe, se deberá seleccionar “VIEW” – “RESULTS” (Figura 16)
Figura 13 Figura 14
Figura 15
– Seleccionar las páginas a imprimir en “PRINT PREVIEW» para obtener la planilla de
resultados (figura 17)
– Para ver un proyecto anterior, seleccionar “FILE”- “OPEN CLASSIFICATION” y elegir el
proyecto deseado
Nota: Todos los procedimientos en el equipo Maldi Biotyper deben realizarse SIN EL USO
DE GUANTES
Importante: el software Flex Control debe permanecer abierto, aún cuando no está en uso
3.5.2.-Revisión de espectros y valores de Score opencv python 다운로드. Análisis de resultados
Se comparan los perfiles proteicos obtenidos de las muestras con la base de datos del equipo
(BD 4612 organismos), y con nuestra Base de Datos.
Se utiliza el criterio de identificación descripto por el fabricante:
Score ≥ 2.000= identificación a nivel de especie
Score 1.700-1.999= identificación a nivel de género
Score < 1.700= no identificación
Se analizan los valores de score de los 10 primeros pocillos (TOP TEN), verificando una
divergencia mayor al 10% entre el resultado de la primer especie y la distinta siguiente.
Cuando se obtienen valores de score menores a 1.700, se deberá optimizar la preparación de la
muestra, ya sea, variando la cantidad de inóculo o utilizando protocolo de extracción distinto del
método directo.
En caso de obtener varias especies con score mayor a 2.000 y sin 10% de divergencia entre dichos
valores, analizar los resultados, agregar pruebas bioquímicas diferenciales o evaluar derivar el
aislamiento al Laboratorio de Referencia para confirmar la identificación.
Figura 16 Figura 17
Nota: La verificación de la identificación por el laboratorio de referencia, se realiza empleando pruebas
bioquímicas convencionales manuales o automatizadas, secuenciación parcial del gen 16S ARNr y
de genes específicos adicionales según normas vigentes del MM18A del CLSI para los distintos
grupos taxonómicos.
Se aceptarán valores de score más bajos para determinados grupos de microorganismos,
previamente validados por Laboratorios de Referencia, para una identificación confiable Download samsung laser printer.
La creación, validación y transferencia de Bases de Datos in house estará a cargo de los
Laboratorios de Referencia pertenecientes a la ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” y al Hospital de
Clínicas José de San Martín.
3.5.3.-Limitaciones
• Shigella sp. no está incluido en la base de datos Maldi Biotyper 3.1 y es considerado como
parte de las especies de E. coli, en consecuencia no arroja un patrón diferente.
• Streptococcus pneumoniae está estrechamente relacionado al grupo de Streptococcus mitis y
podrían producirse errores de identificación.
• Stenotrophomonas maltophilia: tres especies del género Pseudomonas (P. hibiscola,
P. geniculata y P. beteli), están estrechamente relacionadas con S. maltophilia y pueden
obtenerse identificaciones erróneas. La identificación de estos microorganismos debe
considerarse como Stenotrophomonas grupo maltophilia.
• Complejo Acinetobacter baumannii-calcoaceticus (A.baumannii, A. calcoaceticus,
A. genospecies 3, A. genospecies 13), la diferenciación de especie puede ser difícil 꾸러기 훈민정음 다운로드.
• No es posible una segura diferenciación dentro del complejo Enterobacter cloacae.
• Grupo Pseudomonas putida, la diferenciación es limitada al igual que en el Grupo Pseudomonas
fluorescens.
• Bordetella pertussis y B. bronchiseptica están estrechamente relacionadas y muestran un patrón
similar.
• Achromobacter xylosoxidans y A. ruhlandii presentan un patrón similar y no pueden ser
diferenciados.
• Complejo Burkholderia cepacia, la resolución se encuentra limitada.
• Bacteroides nordii y B. salyersiae están estrechamente relacionados y la diferenciación es poco
fiable.
• Género Listeria: sólo Listeria grayi puede ser diferenciada de las otras especies.
• Género Aeromonas: todas las especies presentan un patrón muy similar.
• Klebsiella oxytoca / Raoutella ornitholytica: sus patrones son muy similares.
• Los siguientes agentes potenciales de bioterrorismo no se encuentran en la base de datos
Biotyper 3.1: Clostridium botulinum, Francisella tularensis, Salmonella typhi, Salmonella
paratyphi, Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae, Bacillus anthracis, Brucella melitensis,
Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Yersinia pestis
3.6.-OPERACIONES POST ANALÍTICAS
3.6.1.-Lavado de placas Ver IT –BE-21_00
3.6.2.- DESCARTE DE LAS MUESTRAS: el material estudiado se coloca en bolsas rojas para ser
decontaminado y posteriormente se realiza el descarte final 오늘이 좋다. VER MANUAL DE BIOSEGURIDAD MO-BE-
03_00
4- CONSIDERACIONES ESPECIALES
Trabajar en cabina con guantes de protección cuando se utiliza TFA, ya que el mismo es corrosivo
Evitar la inmersión de la placa dentro de las soluciones de EtOH o TFA. Sólo se debe cubrir la
superficie con los reactivos químicos.
Proteger la superficie de la placa de rayaduras, guardándola en el recipiente de almacenamiento
provisto por Bruker Daltonics.
5. BIBLIOGRAFÍA
• Manual del usuario MALDI Biotyper 3.0. Bruker Daltonics. 2011.
• Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. Organización Mundial de la Salud. Tercera Edición.
Ginebra 2005.
• Interpretive criteria for identification of Bacteria and Fungi by DNA Target Sequencing;
Approved Guideline. MM18-A. Vol 28 No. 12. Clinical and Laboratory Standards InstituteR
(CLSI).
6 ANEXOS
• Planilla de registro de entrega de insumos. FI-BE-17_00
• Planilla de calibración. FI-BE-18_00
• Planilla de registros de muestras. FI-BE-19_00
• Planilla de registro de preparación de insumos para MALDI TOF Download gta3 savefile. FI-BE-20_00